Microscopía CIENCIA

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Ciencia

Introducción. Rama de la Ciencia que trata de la observación de objetos muy pequeños. El ojo, sin ayuda de ningún otro aparato óptico, es capaz de separar dos puntos situados a una distancia mínima de -0,07 mm. Desde que el holandés Leeuwenhoek (1632-1723) construyó sus microscopios y observó por vez primera objetos tales como bacterias, células sanguíneas, etc., la M. ha avanzado sin cesar. Hoy día los microscopios electrónicos, capaces de resolver objetos separados por distancias de hasta 5 A (1 A=10-a cm.), son instrumentos de uso normal en los laboratorios. Por otra parte, las perspectivas abiertas por los aparatos en vías de perfeccionamiento, como p. ej., el microscopio emisor de campo, permiten abrigar esperanzas de logros aún más espectaculares. Vamos a tratar ahora de resumir brevemente las características más importantes de los instrumentos accesibles al investigador en este momento.

Microscopio óptico. El esquema de este aparato está representado en la fig. 1. En síntesis, puede considerarse que una primera lente denominada objetivo, forma una imagen real del objeto y que una segunda, ocular, la amplía posteriormente dando lugar a una imagen final virtual. Esta última es la que se observa con el ojo o se fotografía con una cámara. En realidad las dos lentes mencionadas no son simples, sino que están constituidas por asociaciones de lentes que tienen por objeto la reducción de las aberraciones (v. LENTES; ABERRACIÓN) del sistema. De hecho, buena parte de la labor investigadora que se lleva a cabo en los laboratorios de las firmas más competentes en esta materia (Zeiss, Reichert, etc.) consiste en la puesta a punto de objetivos y oculares cada vez más exentos de dichas aberraciones.

El instrumento posee también el denominado sistema de iluminación. Está en general constituido por un espejo, que recibe el nombre de condensador, y por dos o más diafragmas limitativos. La misión del sistema estriba en la iluminación uniforme del objeto (o de la región de interés de éste). Los microscopistas principiantes conceden escasa importancia al reglaje de la iluminación; sólo la experiencia en el manejo del instrumento conduce a la conclusión de que dicho reglaje es absolutamente imprescindible para una buena observación.

Un cálculo sencillo conduce a la siguiente expresión para el aumento del microscopio:láS flf2 donde 0 representa la distancia entre las dos lentes, 11 y f2 las distancias focales de las mismas y S la distancia mínima de visión distinta para el ojo, que es aproximadamente de 25 cm.

Sin embargo, no es este aumento el que en último término limita las posibilidades del instrumento. En efecto, podría pensarse que la observación de objetos cada vez más pequeños implicaría únicamente la puesta a punto de aparatos de aumento más elevado. Por el contrario, dejando a un lado las dificultades técnicas que, en relación con las aberraciones, , presentaría este aumento progresivo, hay que indicar que el límite último viene impuesto por el poder separador del instrumento.

Es bien conocido el hecho (v. DIFRACCIÓN) de que la imagen óptica de un punto no es otro punto, sino unpequeño disco de difracción. También al estudiar la difracción se enuncia el criterio de Rayleigh que permite discernir si las imágenes de dos puntos están o no separadas. La distancia mínima entre dos puntos en el espacio objeto, tales que sus imágenes queden separadas por el instrumento, recibe el nombre de poder separador o resolución del microscopio. Un cálculo elemental suministra un valor para dicho valor separadorDy=0,61 X/n sen u (2) donde a representa la longitud de onda de la radiación empleada, n el índice de refracción del espacio y u el ángulo de abertura de los rayos incidentes. Este ángulo viene limitado por los diafragmas o aberturas existentes en el sistema y en último término por la montura de la lente objetivo (fig. 1). La magnitud n sen u recibe el nombre de apertura numérica del objetivo y de la ecuación (2) se deduce que para conseguir altas resoluciones (Ay muy pequeña) dicha apertura numérica deberá ser lo más elevada posible. Desgraciadamente, el aumento en los valores del ángulo u lleva consigo la aparición de aberraciones cada vez más intensas, capaces de limitar por sí mismas la resolución del instrumento a causa de la falta de nitidez de la imagen. Por tanto, la única solución aceptable, para aumentar la apertura numérica, estriba en conseguir un n más alto. Éste es el principio básico de los denominados objetivos de inmersión, en los que la muestra se introduce en una gotita de aceite de índice de refracción elevado, que, a su vez, se encuentra en contacto con la cara inferior del objetivo. Utilizando objetivos de inmersión y semiángulos elevados, se pueden conseguir aperturas numéricas de hasta 1,40 y, usando luz visible, el poder de resolución llega a alcanzar el cuarto de micra (0,00025 mm.).

Microscopio electrónico. De la consideración de la ecuación (2), se infiere que el método más directo para conseguir una mejor resolución estriba en utilizar radiación de longitud de onda más corta. Si se tiene en cuenta la composición del espectro electromagnético, se llega a la conclusión de que dicha radiación es precisamente la denominada rayos X (v.). La longitud de onda media de éstos es del orden del angstrom (t1), y, por tanto, es de esperar, con su ayuda, una mejora del poder separador en un factor 1.000. Sin embargo, no se pueden construir microscopios de rayos X, ya que resulta imposible conseguir lentes capaces de hacer converger esta radiación. En último término, esto es debido a que el índice de refracción para los rayos X de todas las sustancias conocidas es prácticamente igual a la unidad.

Felizmente, existe otro tipo de radiación de longitudde onda inferior aún a la de los rayos X, que no presenta esta dificultad: los electrones. Las lentes capaces de hacer converger estos haces electrónicos son de naturaleza eléctrica o magnética (v. ÓPTICA ELECTRÓNICA). La longitud de onda de los electrones depende de su velocidad (es inversamente proporcional a la misma), pero para potenciales aceleradores del orden de 100 Kw., dicha longitud cíe onda vale -0,04 A. Los poderes separadores en los microscopios electrónicos modernos son del arden de unos pocos angstroms. En la fig. 2, se representa una fotografía de un grupo de dislocaciones en un cristal de cobre, obtenida por nosotros en eJ microscopio Philips EM 200 de la Univ. de Madrid.

Otros microscopios. Existen otros tipos de microscopios basados en diferentes principios, que no han alcanzado el grado de utilización de los dos citados. Entre ellos podemos mencionar el ultramicroscopio, en el que se evita que la iluminación entre en el tubo del aparato, permitiendo que lo haga tan sólo la luz esparcida por los diminutos objetos observados. También el microscopio de contraste de fase, en el que se palían las limitaciones del ojo humano, incapaz de apreciar diferencias de fase, trasformando éstas en diferencias de amplitud.

Finalmente, nos vamos a referir a un reciente instrumento, en el que se tienen depositadas las mayores esperanzas: el microscopio emisor de campo. Este aparato basado en un principio diametralmente opuesto a los anteriores, permite alcanzar, en teoría, un poder separador del orden de las dimensiones atómicas. Aunque se encuentra, de momento, en la fase experimentación inicial, ya se han conseguido observar con su ayuda defectos puntuales en redes cristalinas tales como vacantes, impurezas, etc.

V. t.: ÓPTICA 1, 4

J. ROJO ALAMINOS.

BIBL.: L. BRU, Física, Madrid 1967; C. E. HALL, Introducción a la Microscopía electrónica, Madrid (en prensa); P. B. HIRSCH, A. HOWIN, R. E. NICHOLSON, D. W. PASHLEY Y M. J. WHELAN, Electron Microscopy Thin Fims, Londres 1967