Electroforesis FÍS.

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Física

Generalidades. Es el fenómeno de desplazamiento que experimentan ciertos líquidos cuando se introducen en ellos dos electrodos entre los que se aplica una diferencia de potencial eléctrico. Tiene especial importancia en el caso de soluciones coloidales (v. COLOIDES); si se dispone una solución de este tipo en un tubo en U, se vierte sobre ella en cada rama una cantidad de agua, y a continuación se introducen sendos electrodos de carbón, al aplicar a los mismos una diferencia de potencial elevada se puede observar que la disolución coloidal se desplaza en conjunto hacia uno de los electrodos de manera análoga a como lo hacen los iones de determinada carga en cualquier experiencia de electrólisis (v.); ello es debido a que todas las partículas coloidales están cargadas del mismo signo y, en presencia del campo eléctrico, se dirigen hacia el electrodo de signo contrario.

Muchos compuestos orgánicos poseen carga eléctrica positiva o negativa (proteínas) aunque el signo depende del medio en que se encuentren y pueden ser estudiadas y aisladas mediante e. Los bacilos y virus en general también pueden presentar carga eléctrica, y así, si se dispone un cultivo en un tubo en U y se opera en la forma anteriormente descrita, se observará que al paso de la corriente una de las ramas del tubo se aclara a la vez que se enturbia la otra, poniéndose de manifiesto el signo de la carga eléctrica de los bacilos. Esta e. puede llevarse a cabo sobre una preparación observable al microscopio. Si se trata de una mezcla de sustancias cuyas partículas adquieren cargas distintas, los diversos componentes se desplazan hacia los electrodos con velocidades diferentes en el sentido determinado por su correspondiente carga, y, en consecuencia, se van separando. La e. en solución libre tiene algunas aplicaciones en biología y terapéutica.

Pero la importancia de la e. vino a incrementarse cuando en los años cincuenta E. L. Durrum y Arne W. K. Tiselius (bioquímico sueco premio Nobel de Química en 1948 por sus trabajos en esta materia) impulsaron la e. de zona, nombre que se asignó a la separación de materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte además de la solución de electrólito utilizada para transportar la corriente. Es, por tanto, distinta de la e. en solución libre, en que los límites de separación de las sustancias analizadas se observan por medios ópticos. Aunque el término e. se limitó originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscópicas, se ha convertido en los últimos años en un término mucho más general y se aplica a sustancias de bajo peso molecular, como los aminoácidos. De la misma forma, la e. de zona se utiliza ahora para el análisis tanto de materiales de bajo peso molecular como para suspensiones coloidales.

La separación de una mezcla (v.) en zonas bien definidas, a partir de una banda inicial de origen, es difícil de conseguir en solución libre debido principalmente a la gravedad, que actúa sobre las proteínas y puede crear un movimiento de convección que trastoque las zonas, incluso si fuese posible la obtención de una banda de origen bien definida en una disolución. La posibilidad de estabilizar las zonas mediante el empleo de disoluciones de alta densidad ha sido poco estudiada. El procedimiento para dicha estabilización que ha alcanzado mayor aceptación y que ha dado mejores resultados ha sido la utilización de medios de soporte sólidos, tales como sílice gel, agar, polvo de vidrio, arenas de diversos tipos, resinas, polvo de celulosa, fibras de asbesto, etc., obteniéndose resultados más o menos afortunados en la separación de proteínas y sueros de todo tipo. Sin embargo, el mejor desarrollo de la e. coincide con la introducción del papel de filtro como soporte. De la misma forma que en cromatografía (v.), el papel de filtro presenta claras ventajas sobre cualquier tipo de soporte, principalmente por la facilidad de su manejo durante la separación y porque puede ser rápidamente tratado mediante colorantes o reveladores para un estudio permanente.

Procedimientos de separación sobre el papel de filtro. Se han desarrollado tres procedimientos para llevar a cabo la separación electroforética sobre papel de filtro, cada uno de los cuales ha sido ampliamente utilizado, habiéndose obtenido resultados satisfactorios con cada uno de ellos.

El método de Durrum es probablemente el más sencillo de todos y ha dado ciertamente buenos resultados. El papel de filtro humedecido con una solución tampón, reguladora del pH (v.), se cuelga sobre una varilla de vidrio de forma que los extremos del papel queden dentro de los vasos con los electrodos. Todo el aparato se coloca bajo una cubierta de material plástico para mantener la humedad. El material a analizar se coloca normalmente en la parte más alta, sobre la línea de apoyo del papel aunque también se pueden utilizar otras posiciones. En esta separación prácticamente el papel está en posición vertical. La principal dificultad está originada por las variaciones de la concentración en la solución tampón en diferentes puntos del papel, debidas principalmente a evaporaciones parciales y a efectos de gravedad del líquido. El incremento de la concentración de electrólito en porciones del papel tienden a delimitar mejor las bandas, lo cual es ventajoso. Sin embargo, todos estos efectos son variables y perjudican a la reproducibilidad de los experimentos.

En el segundo procedimiento el papel se coloca en posición horizontal, totalmente estirado y bajo una cubierta. En una variante de este método el papel se estira entre dos ejes rotatorios, uno a cada lado y con los extremos del papel dentro de las cavidades de cada electrodo. Mediante este montaje se han podido obtener excelentes resultados, y probablemente se gana en grado de reproducibilidad, aunque no se eliminan totalmente los efectos de evaporación y de gradiente en la concentración de electrólito.

El tercer procedimiento general para la e. en papel de filtro utiliza un montaje en que dicho papel se coloca entre dos placas de vidrio bajo presión. Los extremos del papel sobresalen por ambos lados y se introducen en los vasos de electrodo. El problema de la evaporación, con la consiguiente heterogeneidad en la concentración de electrólito, se puede evitar mediante este procedimiento. Por otra parte, este aparato permite fácilmente la aplicación de un sistema de refrigeración, que, aunque no es necesario para evitar efectos térmicos en el proceso de separación, puede ser importante en el caso de estar trabajando con sustancias biológicamente activas o para evitar una posible multiplicación bacteriana.

En todos estos procedimientos se aprecian algunas desventajas, la más importante de las cuales es, sin duda, la dificultad de reproducir exactamente el mismo resultado de un ensayo a otro. Hay tantas variables en el mismo papel de filtro, en la preparación del papel para la separación, en la concentración de la solución tampón, en el sistema eléctrico, en las condiciones de temperatura, y en el colorante, que prácticamente es imposible evitar pequeñas desviaciones. Se puede considerar también un inconveniente el hecho de que estos procedimientos son prácticamente micrométodos y que en muchos casos es deseable la obtención de cantidades considerables de producto aislado. Esto es particularmente importante en el caso de proteínas, donde otros métodos de análisis preparativos como cromatografía y extracción en contracorriente han tenido hasta ahora limitada aplicación. Se han desarrollado recientemente algunos métodos de e. de papel en régimen continuo, aunque presentan problemas no resueltos respecto a la regulación del flujo de líquido a través del papel y a reacciones en los electrodos originadas por la necesaria proximidad de éstos al flujo de líquido en este procedimiento.

Aplicaciones. Las principales aplicaciones de los procedimientos electroforéticos en papel se han encontrado en el análisis de sueros para fines clínicos, mientras que los procedimientos de solución libre se han empleado principalmente de forma cuantitativa. El método sobre papel ha resultado ser más útil para otros fluidos biológicos en los que es difícil obtener suficiente cantidad mediante e. libre. Un buen ejemplo es el caso del líquido espinal o la determinación de proteínas en la orina. Por otra parte, el procedimiento permite, aparte la determinación de la concentración de cada componente, otros tipos de análisis que pueden ser llevados a cabo sobre los componentes aislados. Otro ejemplo es el estudio de materiales radiactivos en el suero y así se han podido determinar el ciclo de varias seroproteínas mediante la administración de aminoácidos marcados, o la distribución de fósforo radiactivo en distintos sueros y la localización de hierro radiactivo en proteínas. También se ha conseguido la localización de enzimas (v.) mediante medidas analíticas de la actividad enzimática de mezclas biológicas sobre los segmentos de papel que resultan al final de la separación por e. Otro ejemplo de aplicación específica que tiene considerable interés es la localización de los componentes líquidos en el suero, especialmente en el caso del colesterol. Estos estudios son de gran importancia debido a la influencia de las lipoproteínas en el problema de la arterioesclerosis. La separación de péptidos ha sido un problema que presentaba mayores dificultades para los métodos cromatográficos que la de aminoácidos. Por ello, la primera separación de los productos de hidrólisis de proteínas y péptidos de larga cadena se hace mediante e., bien sobre papel o sobre geles. Por este procedimiento se han obtenido resultados que han suministrado suficiente información para facilitar el conocimiento de la secuencia de aminoácidos de la insulina.

Otro campo de aplicación es la separación de hidratos de carbono y de ácidos nucleicos, aunque en este caso ya la cromatografía ha dado resultados satisfactorios.

V. t.: DISOLUCIONES; CONCENTRACIONES; CROMATOGRAFÍA; FILTROS; MEZCLAS, SEPARACIÓN DE.

C. MENDOZA OCHARAN.

BIBL.: L. P. RIBEIRO, E. MITIDIERI, O. R. AFFONSO, Paper electrophoresis, Amsterdam 1961; H. G. KUNKEL, Methods o/ Biochemical analysis, I, Nueva York 1954; 1. CATALÁ, Física General, Valencia 1961.