Microbiología I. Estudio General.

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La M. es la ciencia que estudia los microorganismos, es decir, los seres vivos de tamaño sumamente pequeño. Precisamente, la talla diminuta de estos seres es la que les confiere unas propiedades comunes, que justifican una metodología semejante y que, en consecuencia, dan unidad a la ciencia que los estudia. Por una parte, los microorganismos, debido a unas mínimas dimensiones, tienenuna relación muy grande entre superficie y volumen, tanto mayor cuanto menor sea su tamaño, llegando a poseer una enorme superficie en relación a su volumen. Como la superficie del microorganismo es el lugar material de sus intercambios químicos con el medio ambiente, los materiales nutritivos de este medio ambiente, son aprovechados con gran velocidad, lo que tiene por consecuencia un metabolismo sumamente rápido, a consecuencia de lo cual se producen un crecimiento y una multiplicación extraordinariamente activos. Al mismo tiempo, se produce también una muy rápida difusión al medio de los productos del catabolismo microbiano, de lo que resulta una rapidísima alteración de la composición química del referido medio ambiente. Por otra parte, dado el pequeño tamaño de los microorganismos, es muy fácil su transporte, colonizando así todos los medios naturales.

1. Tipos de microorganismos. En general, los microorganismos viven en forma de unidades celulares independientes, pero en algunos de ellos estas unidades están unidas entre sí formando unos filamentos; se puede decir, pues, que son seres unicelulares o filamentosos. Sin embargo, desde el punto de vista de su organización biológica fundamental, y atendiendo a las características de sus células (v.), se dividen en dos tipos: los procariontes y los eucariontes. Los procariontes se caracterizan por tener el material nuclear compuesto exclusivamente de ácidos nucleicos y dispuesto en forma de un cromosoma anular (sin principio ni fin) no separado del citoplasma por membrana nuclear alguna; son las cianofíceas, las bacterias, los micoplasmas y los virus. Los eucariontes son células con los atributos de las de los organismos superiores, que tienen el material genético distribuido en cromosomas formados por ácidos nucleicos y proteínas y envueltos por una membrana, que delimita un núcleo bien diferenciado: son las levaduras, los mohos, y algunas algas y protozoos

2. Historia de la Microbiología. Los orígenes de la M. empírica se remontan a tiempos muy antiguos, pues en todas las civilizaciones primitivas se han conocido, elaborado y utilizado productos alimenticios y bebidas fermentados, es decir, sometidos a la acción de los microorganismos para cambiar sus propiedades organolépticas y sus efectos sobre el organismo; así, p. ej., el vino y el vinagre en los países mediterráneos, las bebidas de leche fermentada (yogur, kef ir, kumis, etc.) en los países balcánicos y Próximo Oriente, la cerveza en los del norte de Europa, el pulque en México, etc. Pero la historia de la M. científica empieza mucho más tarde, pudiéndose fijar su comienzo en el s. XVII o en el XIX, según el criterio que se adopte.

Efectivamente, el descubrimiento de los microorganismos como seres habitantes de medios naturales, invisibles a simple vista pero perceptibles con ayuda del microscopio, se debe al holandés Antony Van Leeuwenhocck (1632-1723), quien simultaneó sus variadas actividades particulares y oficiales con la afición a la construcción de lentes y la observación de toda clase de materiales naturales con ayuda de dichos instrumentos. Descubrió así un mundo de microorganismos que observaba cuidadosamente, dibujaba y describía, plasmando sus observaciones en unas famosas cartas, dirigidas a la Royal Society de Londres, que las publicaba en sus "Proceedings", las cuales le confirieron gran renombre y le han valido el apelativo de "padre de la Microbiología".

Los trabajos de Van Leeuwenhoeck, a pesar de su importancia, no fueron trascendentes en cuanto al futuro de la ciencia microbiológica, ya que se limitaron a ser puramente descriptivos. Tienen que transcurrir dos siglos hasta que el francés Louis Pasteur (v.) aparezca como el verdadero fundador de la M. moderna. Pasteur era profesor de Química, y los trabajos que comenzaron a darle celebridad y en los que se contenían ya la mayor parte de sus ideas sobre los microorganismos, se realizaron en relación con la antigua polémica científica sobre la generación espontánea.

Desde la Antigüedad hubo filósofos y científicos, entre ellos Aristóteles, que creyeron que muchos de los seres vivos (y singularmente las formas inferiores de vida) podían originarse a partir de la materia inerte. Durante muchos siglos se polemizó sobre este tema y ya hacia mediados del s. XVII el médico italiano Francesco Red¡ demostró que las larvas de moscardas no nacían en un pedazo de carne si se impedía el acceso y la puesta a las moscas adultas, con lo cual destruyó la leyenda de la generación espontánea de los animales; esta idea quedó solamente vigente para los microorganismos, cuya aparición en los líquidos putrescibles y en las infusiones no era fácil de justificar. En 1711, el francés Joblot pudo hacer patente el origen externo de dichos microorganismos, hirviendo unas infusiones que luego se tapaban herméticamente y en las que no aparecían microorganismos a no ser que se expusieran nuevamente al aire. Pero unos años después, en 1749, el naturalista inglés J. T. Needham hizo unos experimentos parecidos a los de Joblot, con resultados contradictorios, con lo que la polémica pudo seguir, incluso después de los trabajos del italiano L. Spallanzani, que mostró claramente los fallos técnicos de Needham. Ésta fue la razón de que Pasteur se decidiera a intervenir en la polémica planeando y ejecutando magistralmente una serie de experimentos cuyos resultados publicó en 1861 bajo el nombre de Mémoire sur les corpuscules organisés yui existent dans l’atmosphére (Memoria sobre los cuerpos organizados que existen en la atmósfera) y que, junto con los trabajos realizados por J. Tyndall poco más tarde en Inglaterra, terminaron definitivamente con la errónea creencia en la llamada generación espontánea.

No se redujo a éste el papel de Pasteur en la M., sino que se extendió a otros aspectos de esta ciencia. Habiendo empezado a estudiar las fermentaciones (v.) desde el punto de vista químico, fue el primero en observar que son debidas a microorganismos y que cada fermentación se origina por la acción de un tipo específico de levaduras o bacterias. Pasteur extendió estas ideas a las enfermedades, siendo, pues, el fundador de la M. médica y veterinaria, en cuyo desarrollo tuvo también un papel primordial, ya que fue el primero en elaborar vacunas con microorganismos "atenuados" (vacuna contra el carbunco, en 1881), si bien la vacuna contra la viruela se practicaba ya de forma sistemática, aunque empíricamente, desde su descubrimiento por el médico inglés Edward Jenner (1749-1823).

Otra figura de singular importancia en esta época de la M. fue el médico alemán Robert Koch (1843-1910; v.), el cual fue capaz, con una larga serie de colaboradores, de establecer técnicas bacteriológicas extraordinariamente útiles (especialmente el empleo de medios de cultivo sólidos) y de identificar una larga serie de microorganismos causantes de enfermedades, estableciendo los célebres postulados de Koch que permitían incriminar seriamente a un determinado microorganismo como causante de una cierta enfermedad. Las investigaciones de Pasteur y de Koch dieron un impulso decisivo a la M. y a sus aplicaciones de toda índole, abriendo un periodo quese ha denominado la "edad de oro" de la M., durante el cual destacan bacteriólogos, higienistas e inmunólogos como J. Lister, F. Lbffler, P. P. Roux, A. Yersin, E. von Behring, S. Winogradsky, P. Ehrlich y otros y que dura aproximadamente hasta los primeros años del s. XX.

La "segundad edad de oro" de la M. comienza inmediatamente después de la II Guerra mundial y se extiende casi hasta nuestros días. Los más importantes hitos de ella son el descubrimiento de los antibióticos, el de la genética de las bacterias y el enorme desarrollo de la inv stigación bioquímica en los microorganismos.

Ya en 1929, el inglés Alexander Fleming (v.) observó en una placa donde cultivaba estafilococos que se le contaminó accidentalmente con un moho, que este último impedía el crecimiento de aquellas bacterias, ejerciendo esta acción inhibidora del crecimiento a cierta distancia del lugar donde el moho crecía; éste resultó ser una especie de Penicillium, que ejercía su acción segregando una sustancia que Fleming llamó penicilina (v.), la cual impedía la reproducción de las bacterias. Fleming no pudo, a pesar de lo que lo intentó, hallar una explicación terapéutica para la penicilina, puesto que, no siendo químico, era incapaz de aislarla y obtenerla en suficientes cantidad y pureza. Esta tarea correspondió a H. Florey y a E. B. Chain, que en 1940 lograron prodigiosos resultados en la lucha contra infecciones bacterianas experimentales con penicilina suficientemente pura. Se comprobó, después, que muchos microorganismos producen sustancias semejantes, a las que se llamó antibióticos (v.), los cuales se utilizan desde entonces muy profusamente en la clínica. También debemos mencionar aquí a S. Waksman, que investigó sistemáticamente sobre los estreptomicetos, obteniendo una serie de antibióticos de gran importancia, especialmente la estreptomicina.

El primer descubrimiento referente a la transferencia genética en las bacterias se remonta a 1928, año en que el inglés F. Griffith descubrió la "transformación", esto es la transferencia de ciertas características genéticas de unos neumococos muertos a otros neumococos vivos, pero hasta 1944 no demostraron el norteamericano O. T. Avery (v.) y sus colaboradores que la acción transformante se debía al ADN. Otro descubrimiento importante en este campo fue el de los norteamericanos J. Lederberg y E. L. Tatum, que pusieron de manifiesto una transferencia genética entre bacterias vivas, por medio de un contacto material entre ellas, la conjugación.

En los últimos años, el prodigioso desarrollo de la Bioquímica, impulsado por unos extraordinarios métodos instrumentales (cromatografía sobre sólidos y sobre gases, uitracentrifugación, marcado por isótopos, etc.), se ha apoyado en gran parte -n el estudio de los microorganismos, que han resultado ser, al mismo tiempo, un objeto de investigación y un instrumento sumamente útil para la Biología molecular; así se han desentrañado los más finos aspectos de la Genética y de la fisiología de bacterias y virus a nivel molecular.

3. Técnica microbiológica. Para el estudio de los m¡croorganismos se ha desarrollado paulatinamente una técnica peculiar, que está condicionada por dos circunstancias: la diminuta talla de los microorganismos y su ubicuidad.

El pequeño tamaño de los microorganismos, hace necesario el empleo de los microscopios y de unas técnicas de fijación y coloración que se parecen bastante a las histológicas, aunque son, en general, bastante más sencillas. La más elemental de ellas, aplicable fundamentalmente a las bacterias, es la coloración simple, con azul de metileno al 2%. Para la observación en vivo se utiliza el procedimiento de la "gota pendiente", en el cual una gota de suspensión del material cuelga de un cubreobjetos colocado sobre un portaobjetos excavado; este procedimiento permite comprobar la movilidad de los microorganismos. Para su tinción con colorantes, los microorganismos se fijan con fijadores tales como el alcohol-éter, el ácido ósmico, etc., pero para las bacterias se suele utilizar la fijación por el calor, haciendo un frotis sobre un portaobjetos y pasando éste horizontalmente (con el frotis hacia arriba) repetidamente por la llama de un mechero Bunsen. Un proceder tintorial muy utilizado para las bacterias es la coloración de Gram, que permite distinguir entre dos tipos de bacterias fundamentalmente diferentes. Se procede así: las bacterias fijadas se colorean con violeta de genciana o con violeta cristal y sin lavar se tratan con yodoyoduro potásico (lugol). Después de un lavado rápido se trata el frotis con alcohol-acetona, que decolora a algunas bacterias, y después con un colorante rojo (fuscina o saframina). Las bacterias grampositivas resisten a la decoloración con el alcohol-acetona y aparecen teñidas en violeta; las gramnegativas se decoloran y se tiñen después por la fuscina (o por la safranina), por lo que aparecen de color rojo. Existen otros procedimientos selectivos para la coloración de determinadas bacterias o de determinadas estructuras de las mismas (flagelos, cápsulas, esporas)

Para la observación de los microorganismos con el microscopio electrónico, se utilizan las técnicas usuales de fijación y de contraste que exige el uso de dicho aparato, especialmente la metalización y la inclusión en materiales plásticos con la ulterior ejecución de cortes ultrafinos

El progreso de la M. desde los tiempos de Pasteur se ha hecho posible mediante las técnicas de cultivo, que permiten el manejo de poblaciones puras de rnicroorganisrnos. Como quiera que los microorganismos están presentes en grandes cantidades en todos los medios y en todos los objetos, es necesario, previo a cualquier tipo de cultivo, proceder a suprimir los microorganismos presentes en los instrumentos que se han de utilizar. Esta operación se llama esterilización y suele realizarse por el calor, por filtración y por los antisépticos. La esterilización por el calor puede utilizar el calor seco o el calor húmedo. En el primer caso se hallan el flameado (pasar el objeto por una llama) y el horno Pasteur, o estufa de esterilización (recipiente cerrado cuyo interior se eleva a 170° C). La esterilización por calor húmedo se hace sobre todo en autoclave, unas veces haciendo obrar el vapor de agua sin presión (vapor fluente) y otras veces (la mayoría) con el vapor de agua a presión, siendo la técnica más frecuente hacer actuar el vapor a 11511C durante 20 min. La esterilización por filtración se realiza principalmente con dos tipos de aparatos: las bujías filtrantes y los filtros. Las primeras pueden ser de porcelana porosa (bujías Chamberland) o de tierra de infusorios (bujías Berkcfeld); los filtros son discos de vidrio poroso (frilté) o de ésteres de celulosa (membranas filtrantes Millipore).

Los antisépticos como agentes de esterilización son poco utilizados en el laboratorio de M., pero se usan con frecuencia en el quirófano, para desinfectar las manos del cirujano (alcohol) o la piel del paciente (tintura de yodo, mercurocromo). Se recurre a ellos para la esterilización de grandes recipientes que no pueden introducirse en el autoclave y se suele utilizar el sublimado (cloruro mercúrico).

Un procedimiento de esterilización de todavía escasa utilización, por la complicación y coste de las instalaciones necesarias, es la irradiación por radiaciones de corta longitud de onda (radiación ultravioleta, radiaciones ionizantes).

Los cultivos. El cultivo de los microorganismos exige primeramente la elaboración de medios de cultivo, sustancias que son, al mismo tiempo, el soporte, el ambiente y el alimento del microorganismo que en ellas vive y se reproduce. Por consiguiente, los medios de cultivo se componen de compuestos químicos apropiados a la nutrición del microorganismo que se trata de cultivar. Los microorganismos fotosintetizantes (flagelados verdes, clorobacteriáceas) crecerán bien en medios que tienen exclusivamente compuestos inorgánicos, adicionados en algunos casos de algún "factor de crecimiento" vitamínico; por el contrario, la mayoría de los microorganismos, que son heterótrofos, exigen medios de cultivo complicados, ricos en sustancias orgánicas. El medio más frecuentemente empleado es el calcio común, que es un extracto de carne muy diluido adicionado en ocasiones de diversos azúcares (glucosa, lactosa).

Es importante distinguir entre medios líquidos y medios sólidos de cultivo. Los medios líquidos se pueden solidificar mediante la adición de sustancias que les den consistencia, como la gelatina o el agar. En los medios líquidos, los microorganismos se extienden en su crecimiento por toda la superficie del líquido y por toda su masa; en los medios sólidos, por el contrario, cuando un microorganismo se multiplica, sus descendientes permanecen agrupados, sujetos por la consistencia del medio, formando así unas masas microbianas separadas unas de otras y perfectamente perceptibles a simple vista, que se denominan colonias. Como cada colonia está formada por microorganismos de la misma especie, los medios sólidos son imprescindibles para separar unas especies microbianas de otras y para manejarlas aisladamente, es decir, permiten el aislamiento y la elaboración de cultivos puros.

Los medios de cultivo se mantienen en recipientes que deben estar cerrados de tal manera que no permitan el paso de microorganismos del exterior, que los contaminarían. Para los medios líquidos se suelen utilizar los tubos de cultivo y los matraces Erlenmeyer, que se tapan por medio de tapones de algodón natural (no hidrófilo) o metálicos. Los medios sólidos se vierten en caliente (en estado líquido) en los recipientes adecuados, en donde se solidifican. Para ello se emplean unas veces los tubos de cultivo tapados con algodón, en los que se deja solidificar el medio de tal manera que, puestos verticalmente, ostentan una superficie horizontal (tubos rectos) o inclinada (tubos inclinados); en determinadas ocasiones, los medios sólidos están contenidos en cajas de Petri, en donde ofrecen una superficie muy amplia.

La primera operación del cultivo es la siembra, que consiste en inocular el medio con el microorganismo deseado. La siembra se hace siempre en un medio estéril y con instrumentos estériles. Estos instrumentos son variados, pero el más utilizado es el asa de cultivo, que es un hilo de platino con el extremo torcido en forma de anillo y que se maneja con un mango; se esteriliza poniéndola al rojo en la llama y, una vez enfriada, se sumerge en el material contaminado, del cual se toma una pequeña cantidad (inóculo) que se lleva al medio líquido que se desea sembrar. Los medios sólidos pueden sembrarse en profundidad (por picadura) o en superficie (en estría).

Después de la siembra viene una operación denominada incubación, que no es otra cosa que poner el medio contaminado en condiciones apropiadas de temperatura para que los microorganismos se multipliquen, es decir, que "crezcan". La incubación se realiza en el interior de unas estufas provistas de un termostato, de modo que su temperatura es constante; aunque cada microorganismo tiene una temperatura óptima de crecimiento, la incubación se suele hacer a 22° C (microorganismos de vida libre) o a 37° C (microorganismos parásitos del hombre y de los demás vertebrados homeotermos). La incubación es más o menos larga, según la rapidez de crecimiento del microorganismo de que se trata, pero de ordinario a las 24 ó 48 h. se puede ya observar un buen crecimiento, que se manifiesta en los medios líquidos por su enturbiamiento y en los medios sólidos por la aparición de colonias en su superficie o en su profundidad (según se haya realizado la siembra).

4. Conservación de los microorganismos. Dado que los microorganismos más genuinos (bacterias y levaduras) tienen una morfología muy simple y de poca utilidad para diferenciar unas especies de otras, su identificación se hace por medio de unas pruebas bioquímicas, que no son otra cosa que detectar sus actividades fisiológicas en unos medios determinados. De aquí la necesidad de formar colecciones de microorganismos vivos. Esto se consigue mediante la práctica de la liofilización, técnica que consiste en congelar el material a muy baja temperatura y desecarlo a continuación en el vacío, con lo cual en los microorganismos quedan suspendidas las funciones vitales, que se pueden reanudar después de varios años al ser colocados nuevamente en medios aptos para su cultivo.

5. Ramas de la Microbiología. La M. se puede dividir en varias ramas, según los microorganismos que estudie y los fines que persiga. Así, pues, la Protozoología (protozoos), la Micología (mohos y levaduras), la Bacteriología (bacterias) y la Virología (virus), son las principales en el primero de aquellos aspectos. Desde el segundo punto de vista, las principales ramas microbiológicas son la M. médica y veterinaria y la M. industrial.

Microbiología médica y veterinaria. Desde su origen, la M. se ha desarrollado principalmente dirigida al estudio de los microorganismos patógenos y a la lucha contra los mismos. En efecto, aunque se puede afirmar que éstos constituyen una minoría, son los más importantes para el hombre. Dentro de este campo, los esfuerzos de los científicos son de dos tipos: los que tratan de combatir a las enfermedades infecciosas en el hombre o el animal enfermos, y los que tienen como fin la protección de los sanos contra la infección. En el primero de los aspectos, la M. ha impulsado principalmente la Quimioterapia, es decir, la utilización de diversas especies químicas que combaten al microorganismo patógeno en el enfermo; en el aspecto sanitario han sido principalmente las técnicas de inmunización (vacunas, sueros) y las medidas higiénicas (limpieza, aislamiento, mejora de alimentación, educación sanitaria) los principales logros.

Microbiología industrial. Esta rama de la M. estudia principalmente los procesos microbiológicos que tienen lugar en la fabricación de diversos productos y la lucha contra el deterioro de los materiales de origen orgánico utilizados por el hombre. Son importantes procesos microbiológicos industriales -los que utilizan los microorganismos para la síntesis de diversos productos químicos, singularmente los de moléculas complicadas que son difícilmente sintetizados por medios exclusivamente químicos. Estas industrias suelen denominarse industrias de la fermentación y entre ellas se encuentran la síntesis de alcohol etílico por bacterias y levaduras, la de butanol por bacterias, la de diversos antibióticos y vitaminas por mohos, etc. Caen también dentro del campo de la M. industrial algunos procesos más complicados, como son el enriado de las fibras textiles vegetales o el ensilado del heno.

Dentro de la M. industrial merece una mención aparte la M. de los alimentos, que se puede también enfocar desde dos distintos puntos de vista. En primer lugar, existen muchos alimentos y bebidas en cuya elaboración intervienen microorganismos, sobre todo levaduras (pan, vino, cerveza) y bacterias (coles fermentadas, café, cacao); en este aspecto tienen una especial importancia los derivados de la leche, como los quesos y las bebidas de leche fermentada: los primeros se elaboran con la intervención de bacterias, a cuyo cargo corre en muchos casos la obtención del coágulo, y de mohos, que dan sus especiales aroma y sabor a los llamados quesos madurados (Roquefort, Cammembert, Cabrales); las bebidas de leche fermentada se fabrican mediante la acción de bacterias (yogur) o de bacterias y levaduras (kejir). El segundo importante aspecto de la M. de los alimentos lo constituye la lucha contra la contaminación de éstos por microorganismos que pueden determinar en el hombre graves enfermedades (difteria, tuberculosis, fiebre tifoidea) o intoxicaciones (botulismo), o que, simplemente, deterioran y descomponen los alimentos haciéndolos inadecuados para su consumo; contra éstos se lucha por medio de las diversas técnicas de conservación (salazón, enlatado, chacina, aditivos, etc.), técnicas que comprenden diversos procedimientos de esterilización (v. CONSERVERA, INDUSTRIA).

Por último, no hay que olvidar que los microorganismos son seres que viven en ambientes naturales y que su sentido puede enfocarse desde el punto de vista ecológico, como M. de los grandes ecosistemas, el mar, las aguas dulces, el aire y el suelo.

V. t.: BACTERIAS; PROTOZOOS; VIRUS; FERMENTACIÓN

D. FERNÁNDEZ-GALIANO

BIBL.: R. Y. STANIER, M. DDUDOROFF y E. A. ADELBERG, El mundo de los microbios, Madrid 1965; M. 1. PELCZAR y R. D. REID, Microbiología, Madrid 1966; L. E. HAWKER, A. H. LINTON, B. F. FOLKES y M. 1. CARLILE, Elementos de Microbiología general, Zaragoza 1964